İnsan p60-katanin Proteininin, Bitki RIC1 ve İnsan Homoloğu Kiaa1432 Proteinleri ile Etkileşiminin Tespiti & Etkileşimin Mikrotubuller Üzerinde Fonksiyonel Analizi

Abstract

Mikrotubuller ihtiyaç durumuna göre uzayıp–kısalabilen, yeniden organize olabilen dinamik yapılı polimerlerdir. Mikrotubul organizasyonu, bölünen hücrelerde mitoz, post-mitotik nöronlarda akson/dendrit yapılarının oluşumunda görevlidir. Mikrotubul organizasyonuna imkan sağlayan mekanizmalardan birisi Katanin gibi mikrotubul kesici proteinlerce kesilmeleridir. Katanin, KATNA1 geni tarafından kodlanan ve enzimatik aktiviteye sahip p60, onun fonksiyonunu düzenleyen ve KATNB1 geni tarafından kodlanan p80 alt birimlerinde oluşmaktadır. Katanin’in bilinen regülatörleri, etkileşim partnerleri yok denecek kadar azdır. Arabidopsis thaliana bitkisinde yapılan çalışmalarda p60-katanin’in bir GTPase olan RIC1 proteini ile etkileştiği ve p60-katanin’in enzimatik aktivitesini arttırdığı gösterilmiştir. Bu sonuçtan hareketle, önerilen proje ile insan p60-katanin proteininin, bitki RIC1 ve insan homoloğu Kiaa1432 proteinleri ile fiziksel etkileşiminin tespiti ve etkileşimin mikrotubul kesimi bakımından fonksiyonel açıdan aydınlatılması amaçlanmıştır. Proteinlerin etkileşim bakımından incelenebilmesi adına ilk olarak bu proteinleri kodlayan cDNA’lar FLAG ve His eki içeren plazmidlere ayrı ayrı klonlanmışlardır. Arabidopsis thaliana p60-katanin ve RIC1 proteinleri Prof. Ying Fu tarafından temin edilmiş olup sadece ilgili plazmidlere aktarılmışlardır. İnsan p60-katanin yürürlükte olan 114Z971 projesi kapsamında FLAG ekli olarak elde edilmiş olup insan Kiaa1432 proteinini kodlayan cDNA klonlanmıştır. Klonlamayı takiben proteinler fiziksel etkileşim bakımından ko-immün çöktürme yöntemiyle test edilmiştir. Son olarak, His ve FLAG ekli olarak klonlanan proteinlerin cDNA’larını içeren plazmidler farklı kombinasyonlar halinde hücreye verilmek suretiyle olası etkileşimin mikrotubul ağına etkisi araştırılmıştır. Yapılan analizlerin sonucunda insan p60-katanin’in Arabidopsis thaliana RIC1 ve bu proteinin insan homoloğu Kiaa1432 proteinleri ile fiziksel etkileşimine rastlanamamıştır.